TESTE DE
IMUNOFLUORESCÊNCIA
O
teste de imunofluorescência é um dos mais utilizados no diagnósticos de
laboratório para a pesquisa de anticorpos e cada vez mais com anticorpos
monoclonais para a pesquisa de microrganismos e seus componentes em espécimes
clínicas. Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem
covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o
antígeno. Os fluorocromos clássicos são a fluoresceína e a rodamina. Após os fluoróforos
serem excitados por um determinado comprimento de onda, emitem fótons de luz
fluorescentes a um comprimento de onda superior.
Teste de
Imunofluorescência Direta
O teste
de imunofluorescência direta é empregado na pesquisa e na localização de
antígenos em células ou tecidos através de um anticorpo específico marcado com
fluorocromo (conjugado). O conjugado se fixa ao antígeno, formando um
imunocomplexo estável. O anticorpo não ligado é removido por lavagens e o
preparado é observado em microscópio de fluorescência.
O teste
tem sido utilizado para a pesquisa de Chlamydia trachomatis, Treponema
pallidum, Legionnella sp, Escherichia coli, estreptococos ß-hemolítico do
grupo A e vários vírus, com os do herpes simples tipo 1 e 2, o citomegalovírus,
os da influenza tipo A e B, os da parainfluenza 1,2 e 3, o da varicela-zoster e
o adenovírus.
Teste de
Imunofluorescência Indireta
A
sensibilidade dos testes de imunofluorescência é limitada ao nível de
fluorescência detectável pelo olho humano; por isso, o teste de imunofluorescência
indireta tem sido empregado para amplificar o sinal e aumentar a sensibilidade.
Pode ser empregado na pesquisa de antígenos ou de anticorpos.
* Para a Pesquisa de Antígenos
Consiste
na incubação da célula ou tecido em que se quer pesquisar o antígeno com o
anticorpo específico obtido em animal conhecido ou monoclonal, levando a
formação de um imunocomplexo. Após a lavagem, a preparação é incubada com um
conjugado de antiimunoglobulina produzida em outra espécie de animal.
* Para a Pesquisa de Anticorpos
Esse
teste refere-se à detecção de anticorpos reativos no soro do paciente utilizando
um segundo anticorpo marcado. Antígenos padronizados são fixados a lâminas de
vidro. O soro do paciente é diluído, colocado sobre o antígeno e incubado para
permitir a formação do complexo antígeno-anticorpo. Após lavagens, a preparação
é incubada com o conjugado fluorescente e, se houver anticorpo no soro, o
conjugado reage com o anticorpo específico para o antígeno. Habitualmente, a
imunofluorescência indireta é utilizada na detecção de auto-anticorpos, e
também, na detecção de anticorpos anti-nucleares encontrados em grande
quantidade no soro de pacientes com doenças autoimunes, como o lúpus
eritematoso sistêmico.
TÉCNICAS COM MARCADORES RADIOATIVOS
Radioimunoensaio
O
radioimunoensaio é um dos métodos mais sensíveis para a análise quantitativa
das reações antígeno-anticorpo, permitindo medidas rápidas e precisas; mesmo em
preparações não purificadas, apresenta limiar de detecção da ordem de
nanogramas ou picogramas. Como limitações destacam-se o custo do teste, a vida
média dos reagentes e o risco operacional.
O
radioimunoensaio pode ser utilizado para quantificar hormônios, drogas,
marcadores tumorais, alérgenos e anticorpos e antígenos em doenças
parasitárias. Há muitas variações, mas o princípio é o mesmo: a quantidade de
reagente marcado (antígeno ou anticorpo) quantifica o antígeno ou anticorpo
não-marcado na amostra.
Radioimunoensaio Direto
No
radioimunoensaio direto, uma quantidade fixa e limitada de anticorpo é ligada a
um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa e pequena de antígeno
marcado, misturada com uma amostra em teste ou com as soluções padrão que
contêm concentrações conhecidas do antígeno não-marcado. Após um período de
incubação, remove-se o antígeno não ligado e faz-se a medida da radioatividade
da fase sólida. A partir da resposta obtida, a concentração do antígeno em
teste é estimada por interpolação na curva.
Radioimunoensaio de competição
No
radioimunoensaio de competição, uma quantidade fixa do antígeno é imobilizada
em um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa de anticorpo marcado
específico, misturada com a amostra em teste ou uma série de soluções padrão
com concentrações variadas do antígeno solúvel. Após um período de incubação, o
anticorpo marcado que não se ligou à fase sólida e o antígeno solúvel são
removidos por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida. A
partir da resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por
interpolação na curva.
Radioimunoensaio de captura
No
radioimunoensaio de captura, uma quantidade fixa de anticorpo é imobilizada em
um suporte. A solução teste, com quantidade desconhecida de antígeno, ou as
soluções padrão, com concentrações conhecidas do antígeno são adicionadas. Após
a incubação, remove-se o antígeno não-ligado e adicionam-se anticorpos marcados
específicos para o antígeno, com sítio de ligação diferente do sítio do
anticorpo de fase sólida. O anticorpo marcado não-ligado é removido por lavagem
e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida. A partir da resposta
obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na
curva.
Fontes:
http://sitebiomedico.br.tripod.com/infeccoes.htm
Ferreira, A. Watter; Ávila, Sandra L.M. Diagnóstico
Laboratorial .1996, editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro - RJ.
http://slideplayer.com.br/slide/334179/
http://www.biomedicinapadrao.com.br/2011/08/ifd.html
Os testes de imunofluorescência evidentemente ampliam as fronteiras na detecção e combate de doenças causadas pelos patógenos abordados (Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Legionnella sp, Escherichia coli, etc.). Entretanto, uma das principais áreas da medicina que se beneficia dessa técnica imunológica é a dermatologia. Atualmente, os estudos de imunofluorescência são determinantes no diagnóstico laboratorial das dermatoses bolhosas autoimunes (doenças cuja manifestação cutânea primária e fundamental consiste em vesículas e bolhas), mas também desempenham importante papel na investigação de outras enfermidades, como: dermatoses inflamatórias (lúpus eritematoso, líquen plano, porfírias, vasculites). Conclui-se então que essas técnicas devem possuir por aperfeiçoamentos constantes para que se possa com êxito, diagnosticar precocemente e tratar rapidamente dessas patologias.
ResponderExcluirFontes: http://www.scielo.br/pdf/abd/v85n4/v85n4a10.pdf
http://www.scielo.br/pdf/abd/v84n2/v84n2a03
O teste de imunofluorescência é de grande importância não apenas para a medicina moderna, como também para as pesquisas. Em uma pesquisa realizada por professores do Departamento de Medicina Comunitária do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Piauí o teste de imunofluorescência indireta foi de suma importância para o andamento do estudo. A pesquisa visava determinar a prevalência da infecção chagásica na população humana em 24 municípios do Estado do Piauí. O teste foi usado para tal pesquisa tanto pela facilidade de utilização como pela sua grande sensibilidade e especificidade. Esse teste foi indicado em 1975 pelo grupo de peritos do CNPq. Tal pesquisa demonstrou um acentuado aumento nas taxas de infecção de acordo com que se chega no sul do estado.
ResponderExcluirReferências:
http://www.scielo.br/pdf/rsbmt/v10n1/03.pdf
A interpretação da imunofluorescência direta (IFD) leva em consideração alguns parâmetros no resulltado do exame: a localização da deposição, o tipo e o número de imunorreagentes presentes e sua relativa intensidade e a "imunomorfologia" da deposição. A imunofluorescência direta é bastante útil na confirmação, por exemplo, do diagnóstico de lúpus quando há suspeita clínica e/ou histopatológica e ainda do grau de avanço da doença utilizando resultado dos parâmetros citados acima. Pode contribuir para a distinção entre os vários subtipos de lúpus eritematoso, já que a freqüência, a morfologia e a localização da deposição dos imunorreagentes variam nos diferentes subgrupos. A IFD pode ajudar ainda na diferenciação entre lúpus e outras doenças que podem ter alterações clínicas e histológicas em comum, como a erupção polimorfa à luz solar e a infiltração linfocítica benigna da pele.
ResponderExcluirÉ importante ressaltar que o Radioimunoensaio clássico baseia-se no princípio da
ResponderExcluirligação competitiva. Quanto maior for o número de anticorpos não marcados no soro, menor será o número de anticorpos marcados capazes de se ligar ao antígeno. Por esse motivo, a radioatividade medida será tanto mais baixa, quanto mais elevado for o título de anticorpos não marcados no soro.
A imunofluorescência não exatamente baseia-se na ligação competitiva, técnica usada acima pelo Samuel para descrever o Radioimunoensaio clássico. No caso da imunofluorescência, o antígeno liga-se às moléculas de fluorocromo sem perder a especificidade para a ligação com o antígeno. Isso pode ser bom, pois não interfere no mecanismo natural de ligação antígeno-anticorpo, mas não é tão produtivo quando se deseja quantificar os anticorpos.
ResponderExcluirFonte: http://sitebiomedico.br.tripod.com/infeccoes.htm
É interessante também falar sobre as técnicas imunoenzimáticas. O enzimaimunoensaio é um método quantitativo em que a reação antígeno-anticorpo é monitorada por medida da atividade enzimática. Desempenha um papel muito importante no laboratório clínico, pois, além da elevada sensibilidade comparável à do radioimunoensaio, apresenta vantagens de utilizar reagentes estáveis, estar livre das exigências de trabalhar com radioisótopos e poder ser adaptado tanto a testes simples como à automação sofisticada.
ResponderExcluir