As
técnicas imunoenzimáticas são baseadas na utilização de antígenos ou anticorpos
marcados com enzimas e permitem a detecção, titulação e quantificação de
substancias de interesse biológico.
As
técnicas para localização de constituintes celulares seguem o mesmo princípio
da imunofluorescência, com a diferença de que, em vez do fluorocromo,
emprega-se a enzima, que tem maior capacidade de amplificação. A enzima
converte o componente cromógeno (substrato+doador de hidrogênios) em produto
insolúvel que precipita no sítio da reação. Esses precipitados podem ser
visíveis ao microscópio eletrônico.
Enzimaimunoensaio
O
enzimaimunoensaio ou ensaio imunoenzimático é um método quantitativo em que a
reação antígeno-anticorpo é monitorada por medida da atividade enzimática.
Desempenha um papel muito importante no laboratório clínico, pois, além da
elevada sensibilidade comparável à do radioimunoensaio, apresenta vantagens de
utilizar reagentes estáveis, estar livre das exigências de trabalhar com
radioisótopos e poder ser adaptado tanto a testes simples como à automação
sofisticada.
Uma
característica comum entre radioimunoensaio e enzimaimunoensaio é que ambos
medem, diretamente, a interação entre o antígeno e o anticorpo, não dependendo
de um segundo fenômeno como precipitação, aglutinação ou fixação de
complemento.
O enzimaimunoensaio
foi classificado em dois tipos: homogêneo e heterogêneo. Nos ensaios homogêneos
não é necessária a separação entre os complexos antígeno-anticorpo e o antígeno
e/ou o anticorpo livres, pois a
interação antígeno-anticorpo modula a atividade da enzima. Nos ensaios
heterogêneos, a separação é necessária, pois a atividade da enzima não é alterada
pela reação antígeno-anticorpo. Os ensaios homogêneos são mais utilizados para
a detecção de haptenos e os heterogêneos para a detecção de moléculas maiores.
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| Conceito de Hapteno |
ELISA (Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzima)
Esse
teste foi desenvolvido como uma alternativa ao radioimunoensaio para a detecção
de antígenos e anticorpos. O seu princípio básico é a imobilização de um dos
reagentes em uma fase sólida, enquanto outro reagente pode ser ligado a uma
enzima, com preservação tanto da atividade enzimática como da imunológica do
anticorpo.
O
teste detecta quantidades extremamente pequenas de antígenos ou anticorpos,
podendo ter elevada precisão se os reagentes e os parâmetros do ensaio forem
bem padronizados.
O
objetivo do ensaio é a quantificação ou verificação da presença de um antígeno
ou anticorpo.
A
enzima mais comumente usada nesta prova é a peroxidase, responsável por
catalisar a reação de desdobramento da água oxigenada (H2O2)
em H2O mais O2.
Existem diversos
tipos de testes de ELISA. O modelo mais simples é conhecido como ELISA
indireto, onde um antígeno que encontra-se aderido a um suporte sólido (placa
de ELISA) é preparado e, em seguida, colocado sobre os soros que estão sendo
testados, em busca de anticorpos contra o antígeno. Caso estejam presentes
anticorpos no soro, específicos para o antígeno em questão, haverá a formação da ligação
antígeno-anticorpo que, por conseguinte, é detectada pela adição de um segundo
anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espécie que está sendo pesquisada,
a qual é ligada a peroxidase. Este anticorpo anti-IgG, ligado à enzima recebe o
nome de conjugado.
O teste de ELISA é responsável pela detecção de diferentes doenças infecciosas, uma vez que a maioria dos agentes patológicos leva à produção de imunoglobulinas. Também pode ser utilizado no diagnóstico de doenças autoimunes ou alergias. É o principal teste no diagnóstico da infecção pelo HIV. Estes testes até a sua terceira geração só detectavam a presença de anticorpos (IgG e IgM) três ou quatro semanas após o contato. No entanto, os testes de quarta geração já detectam tanto anticorpos quanto um dos antígenos do HIV (a proteína p24), fato esse que diminuiu sensivelmente o período de janela imunológica, podendo chegar a apenas duas semanas.
Uma variação do método ELISA utiliza pequenas partículas (1 mm de tamanho) recobertas com o antígeno ou anticorpo apropriado. O MEIA (imunoensaio enzimático de micropartículas), é uma extensão do ensaio de partículas. A vantagem dessas partículas minúsculas é que sua área de superfície relativamente grande resulta em maiores concentrações de antígenos ou anticorpos. Logo, as reações de ligação podem ocorrer mais rapidamente.
SLFIA (Substrate-Labelled
Fluorescent Immunoassay)
Pode ser utilizado
para detectar reagentes de alto e baixo peso molecular. Foi desenvolvido pela
Ames Company of Miles Laboratories. No ensaio, um substrato fluorogênico da ß-galactosidase
é ligado covalentemente a um antígeno protéico ou hapteno. Se o anticorpo
específico reage com antígeno, a enzima ß-galactosidase não cliva o substrato,
por impedimento estérico. Se a amostra tiver antígeno, este se ligará ao
anticorpo e o substrato ligado ao antígeno ficará livre e reagirá com a enzima
para formar o produto fluorescente. O grau de fluorescência é proporcional à
quantidade de antígeno na amostra.
Fontes:
http://sitebiomedico.br.tripod.com/infeccoes.htm
Ferreira, A. Watter; Ávila, Sandra L.M. Diagnóstico
Laboratorial .1996, editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro - RJ.
http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Haptenos&lang=3
http://www.infoescola.com/medicina/teste-elisa/
http://pt.wikipedia.org/wiki/ELISA
http://www.leinco.com/indirect_elisa
Existe, ainda, além das citadas, uma técnica denominada citometria de fluxo, que permite medidas rápidas em partículas ou células enquanto elas passam uma a uma através de um sensor, sendo as medidas realizadas em partícula de cada vez e não como valores médios da população total. Analisa eletronicamente os sinais gerados pelas células em suspensão, quando elas são interceptadas por um feixe de luz que pode ser um laser ou uma lâmpada de arco voltaico, que forneça comprimentos de onda específicos.
ResponderExcluirQuem mexe com técnicas de enzimaimunoensaio, além do bioquímico, é o fármaco analítico que deve estar capacitado para operar os seguintes procedimentos:
ResponderExcluir1) Realizar o diagnóstico sorológico imunológicoas da doença de Chagas utilizando o método de ELISA não competitivo,
2) Equipar o laboratório didático em Imunologia Clínica para atender o ensino no que se diz respeito a automação laboratorial,
3) Proporcionar aos alunos de graduação condições técnicas e práticas para o desenvolvimento de procedimentos relacionados ao diagnóstico sorológico das doenças imunológicas que utilizam a metodologia do ELISA
O método utilizado no teste ELISA Detecta a presença de anticorpo em um soro com o auxílio de uma reação enzimática. Adsorve-se o antígeno na placa de poliestireno. O soro é adicionado na placa, permitindo que os anticorpos específicos liguem-se ao antígenos. Após um período de incubação, a placa é lavada para retirar os anticorpos não ligados. Para detectar os anticorpos ligados a antígenos é utilizado um conjugado (anticorpo anti-imunoglobulina ligado quimicamente a uma enzima). antígenos. Após um período de incubação, a placa é lavada para retirar os conjugados não ligados. É adicionado um substrato cromogênico para detectar a presença da ligação antígeno-anticorpo.
ResponderExcluirhttp://www.portaleducacao.com.br/farmacia/artigos/423/teste-elisa
No caso do teste ELISA, quando adiciona-se o substrato apropriado para a enzima (ou seja, H2O2 dissolvida em uma substância química eu dá uma reação colorida quando H2O2 é desdobrada), os locais onde ocorre a reação antígeno-anticorpo, que apresentam uma coloração característica, sendo que esta coloração varia de acordo com o substrato.A enzima mais comumente usada nesta prova á a peroxidase, responsável por catalisar a reação de desdobramento da água oxigenada (H2O2) em H2O mais O2. A importância e a confiabilidade deste teste na detecção do HIV provavelmente justifica seu amplo uso.
ResponderExcluirFonte: http://www.infoescola.com/medicina/teste-elisa/
Ao tratar desse assunto, também podemos citar a hemaglutinação, técnica em que a utilização de eritrócitos humanos associados aos métodos atuais de preparação antigênica e liofilização possibilita o desenvolvimento de numerosos ensaios de terceira geração para a detecção de auto-anticorpos. Através da reação celular com o anticorpo específico no soro, os eritrócitos aglutinam
ResponderExcluirFonte: http://pt.scribd.com/doc/79265739/Enzimaimunoensaio
Indiscutivelmente, o teste ELISA é indispensável para a determinação de diagnósticos atualmente. Seus avanços levaram e continuam levando a ciência a fronteiras maiores sobre detecção de antígenos. Para comprovar essa ideia, é fato que este método de diagnóstico é o de eleição para a detecção do vírus HIV. Estes testes até a sua terceira geração só detectavam a presença de anticorpos (IgG e IgM) três ou quatro semanas após o contato. Todavia, os testes de quarta geração já detectam tanto anticorpos quanto um dos antígenos do HIV, a proteína p24, fato esse que reduziu sensivelmente o período de janela imunológica, podendo chegar a apenas duas semanas. O aperfeiçoamento progressivo traz novas chances de detecção precoce da doença, antes que danos maiores sejam atingidos, não só para o HIV-Aids, mas também para várias outras patologias.
ResponderExcluirFonte: http://www.infoescola.com/medicina/teste-elisa/
O ELISA indireto é uma técnica utilizada para detecção de anticorpo, sendo assim, pega-se uma placa contendo - aderida na parte solida – antígenos para a patologia a ser analisada e seguem-se as seguintes etapas:
ResponderExcluirColoca-se o soro do paciente nos poços presentes na placa. Se existir presença de anticorpos, esses se ligarão aos antígenos presentes na placa formando um complexo: antígeno (ligado à placa) – anticorpo.
Após esse processo é realizada uma lavagem da placa (essa lavagem é feita usando um tampão de lavagem), para retirar os anticorpos não ligados;
Adiciona-se depois um anti-anticorpo conjugado (por exemplo a uma enzima, como a peroxidase), assim se formará um complexo: anticorpo (ligado à placa) – antígeno – anticorpo – anti-anticorpo conjugado;
Realiza-se outra lavagem, para se retirar o excesso de anti-anticorpo conjugado, que não formou o complexo citado acima;
Nos casos em que o conjugado é uma enzima, adiciona-se um substrato para a enzima (no caso da enzima ser a peroxidase, utiliza-se como substrato o peróxido de hidrogênio e cromógenos). O substrato adicionado, ao se ligar à enzima do complexo, forma um produto colorido;
Por fim adiciona-se uma solução de parada, ou seja, uma solução que interrompa a ação da enzima para que assim a solução não fique com uma coloração muito forte e atrapalhe a leitura do teste.
Referências:
Excluirhttp://www.uft.edu.br/parasitologia/pt_BR/exames/elisa/indireto/index.html