Técnicas de Imunoprecipitação

As técnicas de imunoprecipitação, baseadas na quantificação de precipitados formados pela reação antígeno-anticorpo, começaram em 1897, Rudolf Kraus, em Viena, relatou a precipitação que ocorria pela interação de antígenos solúveis e seus anti-soros correspondentes e, em 1905, Bechhold, na Alemanha, apresentou seus experimentos sobre imunoprecipitados em géis.

A quantidade de precipitado formado quando, a uma concentração constante de anticorpo, se vai adicionando antígeno é caracterizada por uma curva parabólica, descrita por Heidelberger e Kendall em 1935. Essa quantidade de precipitado depende de vários fatores físico-químicos e imunológicos, mas principalmente das concentrações relativas do antígeno e do anticorpo. Quando as quantidades de antígeno e de anticorpo são equivalentes, a precipitação é máxima, decrescendo quando há excesso de antígeno ou de anticorpo. Precipitados já formados podem se dissolver quando expostos a um excesso de um dos reagentes, devido à reversibilidade da ligação antígeno-anticorpo. O fenômeno de prozona ocorre quando há um excesso de anticorpo e pode causar um erro de interpretação dos resultados, sendo necessário que se faça uma titulação do anticorpo com quantidades fixas de antígeno, para evitar tais erros.

Curva de Precipitação

Imunodifusão

A difusão de uma substância solúvel em um meio fluido é um processo pelo qual a substância é transportada, de uma parte para outra, como resultado do movimento molecular ao acaso. A difusão pode ser efetuada em meio gelificado, que impede a formação de correntes, por diferenças de temperatura. Se os poros do gel são consideravelmente maiores do que o tamanho das partículas, a difusão se realiza em meio fluido. Quando os imunoprecipitados são formados no gel ágar, o tamanho dos agregados fica maior do que o diâmetro dos poros e evita-se a difusão dos complexos de antígeno-anticorpo. Dessa forma, as técnicas de imunodifusão detectam a reação antígeno-anticorpo através da formação de um precipitado.

A imunodifusão pode ser simples ou dupla. Na imunodifusão simples, ou o antígeno ou o anticorpo permanecem fixados ao suporte e o outro se difunde, até haver a precipitação do complexo. Na imunodifusão dupla, tanto o antígeno como o anticorpo se movem, um me direção ao outro, até haver a precipitação. Em ambos os casos, a difusão pode ser linear (unidimensional) ou radial (bidimensional). Apesar de sua simplicidade, os métodos de imunodifusão são limitados em virtude da falta de sensibilidade e da necessidade de quantidades relativamente grandes de antígenos e anticorpos precipitantes.

Gel de Ágar

• Imunodifusão Simples Linear

O método de Oudin para a análise qualitativa e quantitativa dos sistemas de precipitação baseia-se na difusão simples em uma dimensão. Nesta técnica, o anti-soro é incorporado ao ágar, sendo essa mistura colocada em um tubo até formar uma coluna de 35-45 mm de altura. Após a gelificação, o antígeno é colocado no topo da coluna. Os tubos são selados, para evitar evaporação, e deixados a uma temperatura constante durante o período de observação, que é, em geral, de uma semana.

• Imunodifusão Radial Simples 

Neste método, o ágar é misturado com a diluição apropriada do anticorpo específico para determinado antígeno e a mistura é colocada em uma lâmina de vidro. Em locais apropriados do gel são feitos orifícios em que se colocam volumes preciosos das soluções de antígeno a serem testadas, bem como soluções-padrão com pelo menos três concentrações conhecidas do antígeno. O suporte é incubado em câmara úmida até que ocorra a difusão, sendo então determinada área do halo de precipitação formado. Para uma dada concentração de anticorpo, a área do halo formado é diretamente proporcional à concentração do antígeno. A sensibilidade do teste pode variar com a concentração do anti-soro. Uma concentração baixa de anti-soro aumenta a sensibilidade, mas não permite a medida de concentrações de antígeno em excesso. Por outro lado, uma alta concentração de anti-soro diminui a sensibilidade, mas permite a quantificação de concentrações maiores de antígeno.

Pelo método de Fahey, os halos de precipitação podem ser medidos antes do término da difusão e, neste caso, o logaritmo da concentração do antígeno é proporcional ao diâmetro do halo. Uma importante aplicação desta técnica é a quantificação das concentrações de imunoglobulinas séricas (IgA, IgG, IgM).

• Dupla Imunodifusão de Ouchterlony

O método baseia-se na precipitação que ocorre na região de equivalência quando o antígeno e o anticorpo se difundem no ágar. A velocidade de difusão de cada substância é regida pelas leis da difusão e depende da concentração e do tamanho da molécula, do tamanho dos poros do gel, da temperatura, da concentração do ágar e de sua pureza.

O teste é realizado colocando-se uma camada de ágar em lâminas de vidro previamente recobertas com uma fina camada de ágar. Após a gelificação, são feitos orifícios no ágar, de acordo com o sistema a ser analisado. As soluções contendo o antígeno e o anticorpo são colocadas nos orifícios do ágar, as placas ou lâminas são incubadas em câmara úmida com vedação a uma temperatura conveniente e constante por 18 a 24 horas.

Cada linha em um espectro de precipitação corresponde a um par de antígeno-anticorpo. A ausência do antígeno ou do anticorpo é indicada pela ausência da linha. Cada precipitado funciona como uma barreira para os reagentes que o formam e impede sua difusão além do sítio da precipitação.

O método de Ouchterlony permite a comparação de vários sistemas antigênicos. O método pode ser utilizado para avaliações semiquantitativas quando se conhece a especificidade das linhas de precipitação, como, por exemplo, na titulação de antígenos ou de anticorpos.

O método apresenta várias limitações pois requer 18 a 24 horas de difusão para que a reação se processe, não sendo útil em casos em que se necessita de um método rápido de diagnóstico.

Eletroimunodifusão

Nas técnicas de imunodifusão, o antígeno e o anticorpo entram em contato e precipitam no ágar por um processo de difusão. Porém, a velocidade de precipitação pode ser muito aumentada se a migração for dirigida por um campo elétrico, como no caso da eletroimunodifusão. Está técnica  tem sido empregada na detecção de antígeno.

• Eletroimunodifusão Dupla Unidimensional

O princípio básico do método é a eletroforese do antígeno e do anticorpo simultaneamente, que migram em direções opostas a partir dos orifícios separados do gel, resultando na precipitação em um ponto intermediário entre as suas origens.

Este método requer que o antígeno e o anticorpo em teste apresentem diferentes mobilidades eletroforéticas. O pH do tampão deve ser escolhido a fim de otimizar os efeitos eletroendosmóticos do anticorpo para o catodo (pólo negativo), enquanto o antígeno se move em direção do anodo (pólo positivo).

• Eletroimunodifusão Simples Unidimensional

Nesta técnica, o anti-soro específico para o antígeno ou antígenos que se quer quantificar é incorporado ao gel, que é colocado em lâmina de vidro numa posição fixa de modo que o anticorpo não migre. O material contendo o antígeno é colocado em um pequeno orifício e é submetido a uma eletroforese. A precipitação se forma nas margens laterais dos limites do antígeno, que à medida que vai precipitando, sua concentração diminui, e as margens laterais convergem para uma ponta. A distância total de migração do antígeno para uma dada concentração de anti-soro é linearmente proporcional à concentração do antígeno.

 

Fontes:

http://slideplayer.com.br/slide/375925/

http://slideplayer.com.br/slide/49576/ http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Imunodifus%C3%A3o&lang=3

http://sitebiomedico.br.tripod.com/infeccoes.htm

Ferreira, A. Watter; Ávila, Sandra L.M. Diagnóstico Laboratorial .1996, editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro - RJ