As técnicas de imunoprecipitação, baseadas na
quantificação de precipitados formados pela reação antígeno-anticorpo,
começaram em 1897, Rudolf Kraus, em Viena, relatou a precipitação que ocorria
pela interação de antígenos solúveis e seus anti-soros correspondentes e, em
1905, Bechhold, na Alemanha, apresentou seus experimentos sobre
imunoprecipitados em géis.
A
quantidade de precipitado formado quando, a uma concentração constante de
anticorpo, se vai adicionando antígeno é caracterizada por uma curva
parabólica, descrita por Heidelberger e Kendall em 1935. Essa quantidade de
precipitado depende de vários fatores físico-químicos e imunológicos, mas
principalmente das concentrações relativas do antígeno e do anticorpo. Quando
as quantidades de antígeno e de anticorpo são equivalentes, a precipitação é
máxima, decrescendo quando há excesso de antígeno ou de anticorpo. Precipitados
já formados podem se dissolver quando expostos a um excesso de um dos
reagentes, devido à reversibilidade da ligação antígeno-anticorpo. O fenômeno
de prozona ocorre quando há um excesso de anticorpo e pode causar um erro de
interpretação dos resultados, sendo necessário que se faça uma titulação do
anticorpo com quantidades fixas de antígeno, para evitar tais erros.
Curva de Precipitação |
Imunodifusão
A difusão de uma substância solúvel
em um meio fluido é um processo pelo qual a substância é transportada, de uma
parte para outra, como resultado do movimento molecular ao acaso. A difusão
pode ser efetuada em meio gelificado, que impede a formação de correntes, por
diferenças de temperatura. Se os poros do gel são consideravelmente maiores do
que o tamanho das partículas, a difusão se realiza em meio fluido. Quando os
imunoprecipitados são formados no gel ágar, o tamanho dos agregados fica maior
do que o diâmetro dos poros e evita-se a difusão dos complexos de
antígeno-anticorpo. Dessa forma, as técnicas de imunodifusão detectam a reação
antígeno-anticorpo através da formação de um precipitado.
A imunodifusão pode ser simples ou
dupla. Na imunodifusão simples, ou o antígeno ou o anticorpo permanecem fixados
ao suporte e o outro se difunde, até haver a precipitação do complexo. Na
imunodifusão dupla, tanto o antígeno como o anticorpo se movem, um me direção
ao outro, até haver a precipitação. Em ambos os casos, a difusão pode ser
linear (unidimensional) ou radial (bidimensional). Apesar de sua simplicidade,
os métodos de imunodifusão são limitados em virtude da falta de sensibilidade e
da necessidade de quantidades relativamente grandes de antígenos e anticorpos
precipitantes.
O método de Oudin para a análise qualitativa e
quantitativa dos sistemas de precipitação baseia-se na difusão simples em uma
dimensão. Nesta técnica, o anti-soro é incorporado ao ágar, sendo essa mistura
colocada em um tubo até formar uma coluna de 35-45 mm de altura. Após a
gelificação, o antígeno é colocado no topo da coluna. Os tubos são selados,
para evitar evaporação, e deixados a uma temperatura constante durante o
período de observação, que é, em geral, de uma semana.
- Imunodifusão Radial Simples
Neste
método, o ágar é misturado com a diluição apropriada do anticorpo específico
para determinado antígeno e a mistura é colocada em uma lâmina de vidro. Em
locais apropriados do gel são feitos orifícios em que se colocam volumes
preciosos das soluções de antígeno a serem testadas, bem como soluções-padrão
com pelo menos três concentrações conhecidas do antígeno. O suporte é incubado
em câmara úmida até que ocorra a difusão, sendo então determinada área do halo
de precipitação formado. Para uma dada concentração de anticorpo, a área do
halo formado é diretamente proporcional à concentração do antígeno. A
sensibilidade do teste pode variar com a concentração do anti-soro. Uma
concentração baixa de anti-soro aumenta a sensibilidade, mas não permite a
medida de concentrações de antígeno em excesso. Por outro lado, uma alta
concentração de anti-soro diminui a sensibilidade, mas permite a quantificação
de concentrações maiores de antígeno.
Pelo
método de Fahey, os halos de precipitação podem ser medidos antes do término da
difusão e, neste caso, o logaritmo da concentração do antígeno é proporcional
ao diâmetro do halo. Uma importante aplicação desta técnica é a quantificação
das concentrações de imunoglobulinas séricas (IgA, IgG, IgM).
- Dupla Imunodifusão de Ouchterlony
O
método baseia-se na precipitação que ocorre na região de equivalência quando o
antígeno e o anticorpo se difundem no ágar. A velocidade de difusão de cada
substância é regida pelas leis da difusão e depende da concentração e do
tamanho da molécula, do tamanho dos poros do gel, da temperatura, da
concentração do ágar e de sua pureza.
O teste é realizado colocando-se uma
camada de ágar em lâminas de vidro previamente recobertas com uma fina camada
de ágar. Após a gelificação, são feitos orifícios no ágar, de acordo com o
sistema a ser analisado. As soluções contendo o antígeno e o anticorpo são
colocadas nos orifícios do ágar, as placas ou lâminas são incubadas em câmara
úmida com vedação a uma temperatura conveniente e constante por 18 a 24 horas.
Cada linha em um espectro de
precipitação corresponde a um par de antígeno-anticorpo. A ausência do antígeno
ou do anticorpo é indicada pela ausência da linha. Cada precipitado funciona
como uma barreira para os reagentes que o formam e impede sua difusão além do
sítio da precipitação.
O método de Ouchterlony permite a
comparação de vários sistemas antigênicos. O método pode ser utilizado para
avaliações semiquantitativas quando se conhece a especificidade das linhas de
precipitação, como, por exemplo, na titulação de antígenos ou de anticorpos.
O
método apresenta várias limitações pois requer 18 a 24 horas de difusão para
que a reação se processe, não sendo útil em casos em que se necessita de um
método rápido de diagnóstico.
Eletroimunodifusão
Nas técnicas de imunodifusão, o antígeno e o
anticorpo entram em contato e precipitam no ágar por um processo de difusão.
Porém, a velocidade de precipitação pode ser muito aumentada se a migração for
dirigida por um campo elétrico, como no caso da eletroimunodifusão. Está
técnica tem sido empregada na detecção
de antígeno.
- Eletroimunodifusão Dupla Unidimensional
O princípio básico do método é a
eletroforese do antígeno e do anticorpo simultaneamente, que migram em direções
opostas a partir dos orifícios separados do gel, resultando na precipitação em
um ponto intermediário entre as suas origens.
Este método requer que o antígeno e o
anticorpo em teste apresentem diferentes mobilidades eletroforéticas. O pH do
tampão deve ser escolhido a fim de otimizar os efeitos eletroendosmóticos do
anticorpo para o catodo (pólo negativo), enquanto o antígeno se move em direção
do anodo (pólo positivo).
- Eletroimunodifusão Simples Unidimensional
Nesta
técnica, o anti-soro específico para o antígeno ou antígenos que se quer
quantificar é incorporado ao gel, que é colocado em lâmina de vidro numa
posição fixa de modo que o anticorpo não migre. O material contendo o antígeno
é colocado em um pequeno orifício e é submetido a uma eletroforese. A
precipitação se forma nas margens laterais dos limites do antígeno, que à
medida que vai precipitando, sua concentração diminui, e as margens laterais
convergem para uma ponta. A distância total de migração do antígeno para uma
dada concentração de anti-soro é linearmente proporcional à concentração do
antígeno.
Fontes:
http://slideplayer.com.br/slide/375925/
http://slideplayer.com.br/slide/49576/ http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Imunodifus%C3%A3o&lang=3
http://sitebiomedico.br.tripod.com/infeccoes.htm
Ferreira, A. Watter;
Ávila, Sandra L.M. Diagnóstico Laboratorial .1996, editora Guanabara
Koogan, Rio de Janeiro - RJ
O método de imunoprecipitação é um método que pode ser utilizado na detecção de várias doenças ou condições de forma mais segura quando comparadas com outros métodos. Como exemplo existe a Diabetes Mellitus Tipo I, que é caracterizado pela presença de auto-anticorpos. Dentre esses autoanticorpos merece destaque o anti-GAD (glutamic acid decarboxilase). Esse apresenta alta prevalência no Diabetes Mellitus Tipo I de início recente e tem sido detectado vários anos antes da instalação da doença. Trabalhos utilizando a técnica da imunoprecipitação demonstraram sensibilidade variando de 74,4 a 100% e especificidade de 84,4 a 100%. Esses índices tornam os exames que trabalham com a imunoprecipitação na detecção do Diabetes Mellitus Tipo I mais confiáveis e pouco passivos de erros e resultados falsos.
ResponderExcluirFonte: http://www.labhpardini.com.br/lab/endocrinologia/diabimun.htm
A imunodifusão é usada para auxiliar no diagnóstico de várias doenças. Uma delas é a paracoccidioidomicose, uma micose profunda causada pelo fungo Paracoccidioides brasilienses. Este fungo vive no solo, alimentando-se de matéria orgânica em decomposição. Os seus esporos se dispersam no ar e podem ser inalados, alojando-se nos pulmões, sendo o foco primário da doença. Em seguida a doença pode se manifestar na pele, mucosas, gânglios e árvores respiratórias.
ResponderExcluirEsta doença foi descrita pela primeira vez em São Paulo, por Adolph Lutz (1908). O diagnóstico da PCM pode ser cruzado com leishmaniose, lupus eritrematoso, tuberculose, sífilis e outros tipos de micoses, como a histoplasmose, a coccidioidomicose e a esporotricose. Em 1994, Taborda e Camargo padronizaram o diagnóstico sorológico da PCM utilizando uma glicoproteína, batizada de GP43, a qual apresenta elevada especificidade no diagnóstico da paracoccidioidomicose. Este antígeno tem sido amplamente utilizado em provas sorológicas, como por exemplo, a técnica de imunodifusão radial dupla.
O teste de imunodifusão radial simples permite determinar a concentração de uma amostra de antígeno.O soro específico é incorporado a agarose que recobre uma lâmina de vidro. Em orifícios feitos na agarose, são adicionadas diferentes concentrações do antígeno.
ResponderExcluirA lâmina é incubada por 24/48 horas. Observa-se o halo de precipitação em volta dos orifícios. Durante a incubação ocorre a difusão do antígeno na agarose, com a formação de complexos antígeno-anticorpo. Os complexos precipitam e formam um halo ao redor do orifício. Existe uma relação linear entre o quadrado do diâmetro do halo e a concentração do antígeno. Com o uso de antígeno de concentrações conhecidas pode-se fazer uma curva padrão, permitindo determinar a concentração em amostras desconhecidas. É possível inverter o teste, incorporando antígeno na agarose e colocando-se soro nos orifícios.
Fonte: PORTAL EDUCAÇÃO
Além da imunoprecipitação, também é muito utilizada a técnica de imunofluorescência. O teste de imunofluorescência é um dos mais utilizados no diagnósticos de laboratório para a pesquisa de anticorpos e cada vez mais com anticorpos monoclonais para a pesquisa de microrganismos e seus componentes em espécimes clínicas. Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o antígeno. Pode ser direta (empregado na pesquisa e na localização de antígenos em células ou tecidos através de um anticorpo específico marcado com fluorocromo, isto é, o conjugado) ou indireta(pode ser empregada na pesquisa de antígenos ou de anticorpos).
ResponderExcluirFonte: http://sitebiomedico.br.tripod.com/infeccoes.htm
Há tambem o teste de imunoprecipitação passiva ou indireta : Para o teste de aglutinação passiva, as hemácias e as partículas inertes (látex, bentonita, “sepharose”, leveduras, etc.) podem ser sensibilizadas por adsorção passiva, devida ao contato direto com os antígenos solúveis, por adsorção via agentes químicos, como ácido tânico, cloreto de cromo e por conjugação do antígeno, por meio de ligações químicas covalentes, fornecendo reagentes estáveis. Devido à grande diversidade de antígenos que podem se ligar às células ou partículas, a aplicação dos testes de aglutinação passiva é muito variada.
ResponderExcluirA ligação que ocorre, na imunoprecipitação, entre um anticorpo a minúsculas esferas agarose geralmente é feita através de uma proteína A mas também pode ser feita através de outras pontes como a biotina/estreptoavidina. Importante mencionar que o lisado deve ocorrer em um meio que permita ligação antígeno/anticorpo, ou seja, com reduzidas concentrações de detergentes não iônicos e condição de pH e força iônica adequadas.
ResponderExcluirFonte: http://diagnosticolaboratorial.com/2010/06/19/imunoprecipitacao/