Testes de Aglutinação

A reação de aglutinação caracteriza-se pela formação de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que contêm determinantes antigênicos em sua superfície. Está entre os imunoensaios mais consagrados e tradicionais. 

A aglutinação pode ocorrer tanto com partículas que apresentam determinantes antigênicos naturais em sua superfície (hemácias, bactérias, protozoários, etc.) como com partículas inertes (partículas de látex, poliestireno, bentonita, etc.). No primeiro caso, a reação é dita aglutinação direta, e no segundo, aglutinação indireta ou passiva. 

As reações de aglutinação são muito empregadas para o diagnóstico laboratorial de doenças causadas por vírus, bactérias, protozoários e fungos, doenças autoimunes, na detecção de hormônios, na tipagem de grupos sanguíneos dos sistemas ABO e Rh, etc. 

Os testes de aglutinação podem ser realizados em tubos ou placas. Se o soro possuir um elevado título de anticorpos aglutinantes, pode-se observar o fenômeno de prozona, já explicado anteriormente, obtendo-se falsos resultados negativos. Esse efeito é eliminado empregando-se  diluições seriadas do soro.

      

Teste de Aglutinação Direta

Na reação de aglutinação direta utilizam-se partículas antigênicas insolúveis em sua forma íntegra ou fragmentada. Hemácias, bactérias, fungos, protozoários podem ser aglutinados diretamente por anticorpo. Os testes para detectar anticorpos específicos são realizados empregando-se diluições em série do anticorpo, frente a uma quantidade constante de antígeno. Após um período de incubação, a aglutinação se completa e o resultado é geralmente expresso como a máxima diluição em que ocorre a aglutinação.

Teste de Aglutinação Direta (Reação Sistema ABO do sangue)

• Teste de Inibição de Hemaglutinação Direta

A inibição da hemaglutinação direta é baseada na capacidade que certos antígenos virais têm de, espontaneamente, aglutinarem certos tipos de hemácias. Os anticorpos, se presentes na amostra, revestem as partículas virais, resultando na inibição da aglutinação, indicando um teste positivo para a presença de anticorpos. Estes testes não distinguem entre IgG e IgM. Este método é usado para detectar anticorpos contra o vírus da rubéola, sarampo, influenza e certos enterovírus.

      

Teste de Aglutinação Passiva ou indireta

Para o teste de aglutinação passiva, as hemácias e as partículas inertes (látex, bentonita, “sepharose”, leveduras, etc.) podem ser sensibilizadas por adsorção passiva, devida ao contato direto com os antígenos solúveis, por adsorção via agentes químicos, como ácido tânico, cloreto de cromo e por conjugação do antígeno, por meio de ligações químicas covalentes, fornecendo reagentes estáveis. Devido à grande diversidade de antígenos que podem se ligar às células ou partículas, a aplicação dos testes de aglutinação passiva é muito variada.

• Teste de Hemaglutinação Passiva

Hemácias estão entre os melhores suportes de antígenos para os testes de aglutinação, pois há uma série de antígenos que pode ser ligada à sua superfície para fornecer um sistema indicador sensível na detecção de anticorpos. Além disso, os testes em placa permitem que a determinação do ponto final da reação seja feita diretamente.

Hemácias possuem uma superfície complexa, o que facilita a ligação de muitos antígenos e, frequentemente, acarreta a presença de anticorpos heterófilos indesejados no soro de muitos animais. Tais anticorpos devem ser removidos antes da execução do teste. Antígenos polissacarídeos prontamente aderem a hemácias, enquanto antígenos protéicos requerem pré-tratamento com ácido tânico ou cloreto de cromo.

O teste em placa utiliza pequenas quantidades de reagentes e é considerado positivo quando se verifica a formação de tapete cobrindo o fundo da cavidade da placa em “V”, e negativo quando as hemácias sedimentam formando um “botão” compacto. O título da amostra testada será a máxima diluição em que ainda se observa a formação do tapete.

O teste detecta anticorpos das classes IgG e IgM e, embora os anticorpos IgM sejam 750 vezes mais eficientes na aglutinação que os IgG, a quantidade de antígeno necessária para se obter a máxima reatividade com IgM é muito maior do que a necessária para a máxima reatividade com IgG.

 

Teste de Hemaglutinação Passiva

•  Teste de Inibição de Hemaglutinação Passiva

O teste de inibição de hemaglutinação passiva é sensível e específico na detecção de pequenas quantidades de antígenos solúveis, haptenos ou anticorpos que competem com a substância homóloga com que a hemácia foi sensibilizada. Desta forma, o princípio do teste baseia-se na competição, pelos sítios de combinação do anticorpo, entre o antígeno fixado à hemácia e o antígeno solúvel ou o hapteno. O grau de inibição relaciona-se com a quantidade do antígeno presente na amostra e, também com a afinidade pelos sítios de combinação do anticorpo.

Este método requer pequenas quantidades de reagentes, apresenta especificidade elevada e pode ser empregado em sistemas em que antígenos solúveis ainda não foram obtidos. Tem sido empregado na detecção de antígeno na hepatite e na hemofilia.

• Teste de Aglutinação do Látex

Partículas de látex são esferas de poliestireno que podem ser utilizadas como suportes na adsorção de proteína solúvel e antígenos polissacarídicos, funcionando como sistema indicador da reação antígeno-anticorpo.

O teste pode ser empregado na pesquisa de antígenos ou de anticorpos. A aplicação mais comum é na detecção do fator reumatoide , que é anticorpo da classe IgM pentamérico dirigido contra IgG. Adsorvendo IgG passivamente às partículas do látex, haverá a exposição dos determinantes de IgG que reagem com o fator reumatoide, resultando em aglutinação. Fator reumatoide (FR) é um anticorpo contra a porção Fc da IgG. O fator reumatoide e a IgG se unem para formar complexos imunes que contribuem para causar doenças reumatológicas. Essa técnica também é empregada na pesquisa da proteína C que aparece no soro de pacientes na fase aguda de várias infecções, como estafilocócica ou estreptocócica, febre reumática, etc.

hCG Látex - Teste de Gravidez (Inibição da Aglutinação)

O hormônio placentário, Gonadotrofina Coriônica Humana (hCG) aparece na urina de mulheres grávidas e geralmente indica um teste positivo de gravidez. O teste é realizado em urina de mulheres, após ausência da menstruação, para detecção de Gonadotrofina Coriônica Humana. O teste irá detectar o hormônio por inibição da aglutinação hCG LÁTEX EBRAM. hCG LÁTEX EBRAM pode detectar a gravidez positiva após 3 dias de atraso da menstruação. Porém, resultados negativos podem ser observados em testes de gravidez realizado precocemente, devido ao baixo nível de hCG. Nestes casos, os testes poderão ser repetidos depois de uma semana. Os componentes do teste consistem de um antígeno na forma de suspensão de hCG aderidos na superfície das partículas de látex e um reagente contendo anticorpos anti-hCG, subunidade Beta. O hCG aderido às partículas de látex irá reagir com anticorpos e causar aglutinação do mesmo. Quando o anticorpo é misturado com hCG da urina de mulheres grávidas, o anticorpo é bloqueado e não irá aglutinar o látex. Não havendo hCG na urina, o anticorpo não será bloqueado e o látex irá aglutinar. Assim, a aglutinação do látex indica um teste de gravidez negativo.

Fontes: 

http://slideplayer.com.br/slide/375946/

http://pt.wikipedia.org/wiki/Fator_reumatoide

http://www.ebram.com/intuse/906.intuse.pdf

http://sitebiomedico.br.tripod.com/infeccoes.htm

Ferreira, A. Watter; Ávila, Sandra L.M. Diagnóstico Laboratorial .1996, editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro - RJ.

Técnicas de Imunoprecipitação

As técnicas de imunoprecipitação, baseadas na quantificação de precipitados formados pela reação antígeno-anticorpo, começaram em 1897, Rudolf Kraus, em Viena, relatou a precipitação que ocorria pela interação de antígenos solúveis e seus anti-soros correspondentes e, em 1905, Bechhold, na Alemanha, apresentou seus experimentos sobre imunoprecipitados em géis.

A quantidade de precipitado formado quando, a uma concentração constante de anticorpo, se vai adicionando antígeno é caracterizada por uma curva parabólica, descrita por Heidelberger e Kendall em 1935. Essa quantidade de precipitado depende de vários fatores físico-químicos e imunológicos, mas principalmente das concentrações relativas do antígeno e do anticorpo. Quando as quantidades de antígeno e de anticorpo são equivalentes, a precipitação é máxima, decrescendo quando há excesso de antígeno ou de anticorpo. Precipitados já formados podem se dissolver quando expostos a um excesso de um dos reagentes, devido à reversibilidade da ligação antígeno-anticorpo. O fenômeno de prozona ocorre quando há um excesso de anticorpo e pode causar um erro de interpretação dos resultados, sendo necessário que se faça uma titulação do anticorpo com quantidades fixas de antígeno, para evitar tais erros.

Curva de Precipitação

Imunodifusão

A difusão de uma substância solúvel em um meio fluido é um processo pelo qual a substância é transportada, de uma parte para outra, como resultado do movimento molecular ao acaso. A difusão pode ser efetuada em meio gelificado, que impede a formação de correntes, por diferenças de temperatura. Se os poros do gel são consideravelmente maiores do que o tamanho das partículas, a difusão se realiza em meio fluido. Quando os imunoprecipitados são formados no gel ágar, o tamanho dos agregados fica maior do que o diâmetro dos poros e evita-se a difusão dos complexos de antígeno-anticorpo. Dessa forma, as técnicas de imunodifusão detectam a reação antígeno-anticorpo através da formação de um precipitado.

A imunodifusão pode ser simples ou dupla. Na imunodifusão simples, ou o antígeno ou o anticorpo permanecem fixados ao suporte e o outro se difunde, até haver a precipitação do complexo. Na imunodifusão dupla, tanto o antígeno como o anticorpo se movem, um me direção ao outro, até haver a precipitação. Em ambos os casos, a difusão pode ser linear (unidimensional) ou radial (bidimensional). Apesar de sua simplicidade, os métodos de imunodifusão são limitados em virtude da falta de sensibilidade e da necessidade de quantidades relativamente grandes de antígenos e anticorpos precipitantes.

Gel de Ágar

• Imunodifusão Simples Linear

O método de Oudin para a análise qualitativa e quantitativa dos sistemas de precipitação baseia-se na difusão simples em uma dimensão. Nesta técnica, o anti-soro é incorporado ao ágar, sendo essa mistura colocada em um tubo até formar uma coluna de 35-45 mm de altura. Após a gelificação, o antígeno é colocado no topo da coluna. Os tubos são selados, para evitar evaporação, e deixados a uma temperatura constante durante o período de observação, que é, em geral, de uma semana.

• Imunodifusão Radial Simples 

Neste método, o ágar é misturado com a diluição apropriada do anticorpo específico para determinado antígeno e a mistura é colocada em uma lâmina de vidro. Em locais apropriados do gel são feitos orifícios em que se colocam volumes preciosos das soluções de antígeno a serem testadas, bem como soluções-padrão com pelo menos três concentrações conhecidas do antígeno. O suporte é incubado em câmara úmida até que ocorra a difusão, sendo então determinada área do halo de precipitação formado. Para uma dada concentração de anticorpo, a área do halo formado é diretamente proporcional à concentração do antígeno. A sensibilidade do teste pode variar com a concentração do anti-soro. Uma concentração baixa de anti-soro aumenta a sensibilidade, mas não permite a medida de concentrações de antígeno em excesso. Por outro lado, uma alta concentração de anti-soro diminui a sensibilidade, mas permite a quantificação de concentrações maiores de antígeno.

Pelo método de Fahey, os halos de precipitação podem ser medidos antes do término da difusão e, neste caso, o logaritmo da concentração do antígeno é proporcional ao diâmetro do halo. Uma importante aplicação desta técnica é a quantificação das concentrações de imunoglobulinas séricas (IgA, IgG, IgM).

• Dupla Imunodifusão de Ouchterlony

O método baseia-se na precipitação que ocorre na região de equivalência quando o antígeno e o anticorpo se difundem no ágar. A velocidade de difusão de cada substância é regida pelas leis da difusão e depende da concentração e do tamanho da molécula, do tamanho dos poros do gel, da temperatura, da concentração do ágar e de sua pureza.

O teste é realizado colocando-se uma camada de ágar em lâminas de vidro previamente recobertas com uma fina camada de ágar. Após a gelificação, são feitos orifícios no ágar, de acordo com o sistema a ser analisado. As soluções contendo o antígeno e o anticorpo são colocadas nos orifícios do ágar, as placas ou lâminas são incubadas em câmara úmida com vedação a uma temperatura conveniente e constante por 18 a 24 horas.

Cada linha em um espectro de precipitação corresponde a um par de antígeno-anticorpo. A ausência do antígeno ou do anticorpo é indicada pela ausência da linha. Cada precipitado funciona como uma barreira para os reagentes que o formam e impede sua difusão além do sítio da precipitação.

O método de Ouchterlony permite a comparação de vários sistemas antigênicos. O método pode ser utilizado para avaliações semiquantitativas quando se conhece a especificidade das linhas de precipitação, como, por exemplo, na titulação de antígenos ou de anticorpos.

O método apresenta várias limitações pois requer 18 a 24 horas de difusão para que a reação se processe, não sendo útil em casos em que se necessita de um método rápido de diagnóstico.

Eletroimunodifusão

Nas técnicas de imunodifusão, o antígeno e o anticorpo entram em contato e precipitam no ágar por um processo de difusão. Porém, a velocidade de precipitação pode ser muito aumentada se a migração for dirigida por um campo elétrico, como no caso da eletroimunodifusão. Está técnica  tem sido empregada na detecção de antígeno.

• Eletroimunodifusão Dupla Unidimensional

O princípio básico do método é a eletroforese do antígeno e do anticorpo simultaneamente, que migram em direções opostas a partir dos orifícios separados do gel, resultando na precipitação em um ponto intermediário entre as suas origens.

Este método requer que o antígeno e o anticorpo em teste apresentem diferentes mobilidades eletroforéticas. O pH do tampão deve ser escolhido a fim de otimizar os efeitos eletroendosmóticos do anticorpo para o catodo (pólo negativo), enquanto o antígeno se move em direção do anodo (pólo positivo).

• Eletroimunodifusão Simples Unidimensional

Nesta técnica, o anti-soro específico para o antígeno ou antígenos que se quer quantificar é incorporado ao gel, que é colocado em lâmina de vidro numa posição fixa de modo que o anticorpo não migre. O material contendo o antígeno é colocado em um pequeno orifício e é submetido a uma eletroforese. A precipitação se forma nas margens laterais dos limites do antígeno, que à medida que vai precipitando, sua concentração diminui, e as margens laterais convergem para uma ponta. A distância total de migração do antígeno para uma dada concentração de anti-soro é linearmente proporcional à concentração do antígeno.

 

Fontes:

http://slideplayer.com.br/slide/375925/

http://slideplayer.com.br/slide/49576/ http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Imunodifus%C3%A3o&lang=3

http://sitebiomedico.br.tripod.com/infeccoes.htm

Ferreira, A. Watter; Ávila, Sandra L.M. Diagnóstico Laboratorial .1996, editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro - RJ